Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程中逐渐拓展

从第一次显现出新口内自身抗纤到显现出新1标准型肝炎流行病学腹泻的令人满意率在孩童中会后期就有很好的说明了，多个口内自身抗纤阳性的孩童中会有70%在胰岛素切换后10周内患上肝炎，而随访15年的孩童这一比重减小到84%。相对之下，占流行病学1标准型肝炎一半以上的标准型1标准型肝炎的得病机制还无法获取充份的研究。

日渐多的人开始适用分期系统会来定义1标准型肝炎的令人满意：个纤在显现出新多种口内自身抗纤时进到第1阶段，显现出新血糖反常时进到第2阶段，显现出新腹泻时进到第3阶段。一些多发口内自身抗纤阳性的个纤，在1期和2期，令人满意较较慢，并蓬勃发展为得病的1标准型肝炎。我们先前说明了了一分组在首次检测到多种口内自身抗纤样本后多于10年无肝炎的正因如此较慢令人满意者，这分组患儿000人少，但特质非常明确。随后，我们发现口内自身淋巴细胞特异性CD8+T肝细胞反应将在令人满意减较慢的患儿中会也就是说不存有，但在近期得病和长期存有的肝炎患儿中会很不易检测到。这意味著确实，与令人满意患儿相对，这些患儿自身免疫反应将的调节增强。

以前研究确实，尽管调节性T肝细胞(Treg)数量正常，但肝炎患儿存有一些新功能缺陷，其中会以外对IL-2的反应将能够降低。此外，肝炎患儿中会的振荡CD4+T肝细胞意味著对调节更具抵抗性，乏善可陈为振荡T肝细胞的消除减弱，自然激发的Treg和粘液激发的诱发Treg，以及淋巴细胞随之而来的CD4+T肝细胞中会IL-2反应将减弱。本研究的借以是说明了了CD4+调节性T肝细胞(Treg)在一小群正因如此减较慢令人满意者中会的特质，他们的平均年长为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

方法：BOX研究是一项以人群依此的纵向研究，在21岁以下就诊的患儿亲属中会检验1标准型肝炎的危险性因素。我们先前说明了了长期减较慢令人满意者的特质，他们保持多重口内自身抗纤阳性少于10年，但无法显现出新肝炎的流行病学腹泻，较慢性或非完成性自身免疫。随后，10名先前保持无肝炎并愿意以外大量肾脏样本的减较慢令人满意者确立T和B肝细胞新功能分析。在迄今为止的研究中会，8名较慢令人满意者(SP分组)，中会位年长43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的口内自身抗纤阳性。所有的与会者都属于1标准型肝炎令人满意的1期，尽管一些人随后失去了口内自身抗纤对某些淋巴细胞的阳性反应将，然而，一名患儿已经属于2期多于6年，但无法显现出新流行病学腹泻，一名患儿被诊断为肝炎，该受试者72岁，在采集检验样本时，其HbA1c升温到53 mmol/mol(7%)，在数据分析中会对该小分子完成了实质上分析报告。转化外周血单个氢肝细胞(PBMCs)，采用多变量流式肝细胞术和T肝细胞消除试验分析报告小分子中会Treg的频带、遗传基因和新功能。适用FlowSOM和CITRUS(聚类鉴定、表征和转回)完成无指派聚类分析，分析报告Treg遗传基因。

结果：与保健小分子相对，来自较慢令人满意纤的知觉CD4+T肝细胞的指派聚类辨识，这样的话的知觉CD4+ Treg频带减小，与免疫抑制诱发的TNFR具体蛋白(GITR)强调减小有关。一名HbA1c升温的患儿与令人满意减较慢者和反之亦然的对照分组相对，Treg谱有所不尽相同。新功能分析确实，与保健小分子相对，来自减较慢令人满意纤的Treg介导的CD4+振荡T肝细胞消除明显受损。乏善可陈为对振荡CD4+T肝细胞CD25和CD134强调的消除减小。

上图1 深入的遗传基因分析辨识，CD4+Treg共通点在较慢令人满意缓冲区中会减小。由FlowSOM生成的Treg室，涌进在来自所有小分子的活CD4+CD45RA -肝细胞上。根据标识物强调鉴定出新10个元簇:知觉T肝细胞_1;知觉T cell_2;知觉T cell_3;知觉T cell_4;CD49b知觉T肝细胞;HLA-DR + GITR +知觉T肝细胞;CPUTreg_1;CPUTreg_2;CPUTreg_3;和CPUTreg_4。(a)适用9个不尽相同Treg标识生成的10个元簇的MST。每个结点象征性一个炮兵部队(100个炮兵部队)，非常大的元炮兵部队(10个元炮兵部队)在结点分组外面上色。每个结点中会的饼上图透露单个标识的强调档次。(b)每个元聚类的热上图，以辨识整纤标识强调。(c, d)为HD分组(c)和SP分组(d)生成上图，以及FlowSOM鉴别的每个元簇的沙质。(e-l)相对于总质量为每个metacluster装终点站上图(总质量> 0.05%)断定为HD和SP分组:CPUTreg_2 (e),CPUTreg_3 (f),CPUTreg_4 (g), HLA-DR + GITR +知觉T肝细胞(h)、知觉T cell_1(i),知觉T cell_2 (j),知觉T cell_3 (k) n d CD49b知觉T肝细胞(l)。橙色左上方象征性ACSSP 606。**p< 0.01, Wilcoxon配对字母秩检验。此键适用于上图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

上图2 适用CITRUS的预测模标准型确认，Treg频带的减小是令人满意减较慢的标志。PG依赖型(a - f)和柑橘分析(g-k)比较SP与会者和反之亦然的HD与会者在CD4+CD45RA−T肝细胞上的差异。(a)亲本CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群纤的纪念性上图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3富集，然后通过HLA-DR和GITR强调完成转化，模拟FlowSOM群纤。(b) HD(网纹)和SP(白点)分组以及小分子SP 606(橙色)中会CD25+ cd127的频带汇总上图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+依赖型子集的装终点站上图;(c) HLA-DRloGITR−(CPUTreg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(CPUTreg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(CPUTreg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+CPUT cell)。(g - i)柑桔簇螺旋状由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3强调其中心着色，上标出新彩的簇被鉴别为SP和HD缓冲区之间的不尽相同。(j)装终点站上图辨识了在SP(白点)和HD(灰点)分组中会，CITRUS知觉Treg_3和Treg_4的相对于总质量(比重)。(k)控制点辨识每个簇的遗传基因(黄色)和Treg标识相对于强调与背景强调(红色);上列，CPUTreg_3;下面一行，CPUTreg_4。背景与所有其他簇中会标识的强调有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon配对字母秩检验

上图3 与保健献血者相对，令人满意减较慢者知觉treg的GITR减小。每个知觉CD4+T肝细胞元簇(知觉T肝细胞_1;知觉T cell_2;知觉T cell_3;CD49b +知觉T肝细胞;HLA-DR + GITR +知觉T肝细胞;CPUTreg_2;CPUTreg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)检测每个强调标识的发生变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)缓冲区的强调热上图(sp606不以外在内)。(c,d)知觉Treg_4元簇中会所有HD(灰色)、所有SP(红色)和SP 606(橙色)的FlowSOM GITR强调接在，辨识控制点(c)和汇总上图(d)。Wilcoxon配对字母秩和检验，p< 0.07(橙色)所有小分子以外，p< 0.05(红色)小分子SP 606和反之亦然的HD不以外在测试中会。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs中会GITR强调，从PG依赖型，从所有HD(灰色)、所有SP(红色)和SP 606(橙色)接在，辨识控制点(e)和汇总上图(f) *p< 0.05, Wilcoxon配对字母秩检验

上图4 来自减较慢令人满意的CD4+ treg肝细胞控制振荡CD4+T肝细胞的能够降低。SP分组用红色的终点站和左上方透露，HD分组用黑色的终点站和左上方透露，橙色的终点站/左上方透露小分子sp606。适用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T肝细胞完成分选。CD4+CD25−(应将答者)被标识为CFSE, Treg按仔细观察的比重校准。用抗CD3 /28微珠活化肝细胞，培养出新来3在此之后完成流式肝细胞术检测。(a-d)与CD4+应将答者相对于应将的treg培养出新来(自纤)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD应将答者培养出新来。(a,b,f) CFSE诱发(a,e)和CFSE消除百分比(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的消除百分比。适用阳性对照(这样的话的响应将肝细胞仅有treg)计算消除百分比。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

上图5 振荡CD4+T肝细胞对减较慢令人满意的T肝细胞活化的消除更敏感。SP分组用红色的终点站和左上方透露，HD分组用黑色的终点站和左上方透露，橙色的终点站/左上方透露小分子sp606。适用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T肝细胞完成分选。CD4+CD25−(应将答者)被cfsel标识，treg按仔细观察的比重校准。用抗CD3 /28微珠活化肝细胞，培养出新来3在此之后完成流式肝细胞术(CD25反染)和肝细胞因子分析。HD Treg与HD、SP或sp606应将答者共同培养出新来。(a,b) CFSE诱发(a)和CFSE消除百份(b)。(c,d) CD25消除百份(c)和CD134消除百份(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共培养出新来中会的强调。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

结论：我们算出新的结论是，来自减较慢令人满意子的活化知觉CD4+Treg在GITR强调中会获取了延展和多样，强调了进一步研究Treg在1标准型肝炎高风险个纤中会的举例来说的有效性。

原文出新处：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28